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蛋白质提取技术

      蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识,但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组
分分配率的差别,把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中,如盐析,有机溶剂提取,层析和结晶等;
二是将混合物置于单一物相中,通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的,如电泳,超速离心,
超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性,防止酸、硷、高温,剧烈机械作用而导致所
提物质生物活性的丧失。

蛋白质的制备一般分为以下四个阶段:
1)选择材料和预处理
2)细胞的破碎及细胞器的分离
3)提取和纯化
4)浓细、干燥和保存

                                                     
蛋白质的分离纯化方法很多,主要有:
(一)根据蛋白质溶解度不同的分离方法
1、蛋白质的盐析
  中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响,一般在低盐浓度下随着盐浓度升高,蛋白质的溶解度增加,此称盐溶;
当盐浓度继续升高时,蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出,这种现象称盐析,将大量盐加到蛋白质溶液中,
高浓度的盐离子(如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力,可夺取蛋白质分子的水化层,使之“失水”,于是蛋
白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程
度不同,故盐析所需的盐浓度也不一样,因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。

影响盐析的因素有:
(1)温度:除对温度敏感的蛋白质在低温(4度)操作外,一般可在室温中进行。一般温度
低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质(如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白)在较高的温度(25度)比0度时溶解度低,更
容易盐析。
(2)pH值:大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。
(3)蛋白质浓度:蛋白质浓度高时,欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来(共沉现象)。因此在盐析前血清要
加等量生理盐水稀释,使蛋白质含量在2.5-3.0%。蛋白质盐析常用的中性盐,主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、
磷酸钠等。 其中应用最多的硫酸铵,它的优点是温度系数小而溶解度大(25度时饱和溶液为4.1M,即767克/升;0度时饱和
溶解度为3.9M,即676克/升),在这一溶解度范围内,许多蛋白质和酶都可以盐析出来;另外硫酸铵分段盐析效果也比其他
盐好,不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间,当用其他pH值进行盐析时,需用硫酸或氨水调节。
  蛋白质在用盐析沉淀分离后,需要将蛋白质中的盐除去,常用的办法是透析,即把蛋白质溶液装入秀析袋内(常用的是玻
璃纸),用缓冲液进行透析,并不断的更换缓冲液,因透析所需时间较长,所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-
25或G-50过柱的办法除盐,所用的时间就比较短。
2、等电点沉淀法
  蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小,因而溶解度也最小,各种蛋白质的等电点有差别,可利用调节
溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀,但此法很少单独使用,可与盐析法结合用。
3、低温有机溶剂沉淀法
  用与水可混溶的有机溶剂,甲醇,乙醇或丙酮,可使多数蛋白质溶解度降低并析出,此法分辨力比盐析高,但
蛋白质较易变性,应在低温下进行。

(二)根据蛋白质分子大小的差别的分离方法
1、透析与超滤
  透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。
  超滤法是利用高压力或离心力,强使水和其他小的溶质分子通过半透膜,而蛋白质留在膜上,可选择不同孔径
的泸膜截留不同分子量的蛋白质。
2、凝胶过滤法
  也称分子排阻层析或分子筛层析,这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充
材料是葡萄糖凝胶(Sephadex ged)和琼脂糖凝胶(agarose gel)。

(三)根据蛋白质带电性质进行分离

蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同,可将其分开。
1、电泳法

  各种蛋白质在同一pH条件下,因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等
电聚焦电泳,这是利用一种两性电解质作为载体,电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度,当
带一定电荷的蛋白质在其中泳动时,到达各自等电点的pH位置就停止,此法可用于分析和制备各种蛋白质。
2、离子交换层析法
  离子交换剂有阳离子交换剂(如:羧甲基纤维素;CM-纤维素)和阴离子交换剂(二乙氨基乙基纤维素;DEAE?
FONT LANG="ZH-CN">纤维素),当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时,带有与离子交换剂相反电荷的
蛋白质被吸附在离子交换剂上,随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。(详见层析技术章)

(四)根据配体特异性的分离方法-亲和色谱法
  亲和层析法(aflinity chromatography)是分离蛋白质的一种极为有效的方法,它经常只需经过一步处理即可
使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来,而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种
称为配体(Ligand)的分子能特异而非共价地结合。其基本原理:蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存
在,每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质,因此蛋白质的分离(Separation),提纯(Purification)和鉴定
(Characterization)是生物化学中的重要的一部分,至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从
复杂的混合蛋白质中提取出来,因此往往采取几种方法联合使用。
 
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