Fluo-8® 钙离子指示剂 | 室温负载、亮度2倍于Fluo-4的钙探针
Fluo-8®系列钙离子指示剂
Fluo-8® Indicators
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⇓ 导读 Fluo-8® 是一种绿色荧光钙离子指示剂，用于监测细胞内 Ca²⁺ 浓度和钙流动态。它保留了与 Fluo-4 相同的光谱特性，同时解决了 Fluo-3 和 Fluo-4 的关键局限性——尤其是对细胞负载温度的严格要求。与需要在 37°C 下负载的 Fluo-3 AM 和 Fluo-4 AM 相比，Fluo-8® 可在室温下高效负载，负载时间最短仅需 20 分钟，同时亮度达到 Fluo-4 的 2 倍、Fluo-3 的 4 倍。 |
Fluo-8® 是一种绿色钙离子指示剂，可用于监测细胞内的 Ca²⁺ 浓度和钙流动态。它采用了与Fluo-3和Fluo-4相同的荧光素核心结构。这使得Fluo-8®能够保留与Fluo-4完全相同的光谱特性，同时解决了Fluo-3和Fluo-4的特定局限性，尤其是染料负载的温度依赖性。与需要在37°C温度下负载的Fluo-3和Fluo-4相比，Fluo-8®可在室温下高效负载，且负载时间缩短至仅需20分钟。
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Fluo-8® 钙离子指示剂用于钙成像
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与其他 Fluo 染料一样，Fluo-8® 在无 Ca²⁺ 形式下不发光。结合 Ca²⁺ 后，Fluo-8® 显示出约 200 倍的荧光强度增强。这使其明显亮于之前的钙指示剂：是 Fluo-4 的 2 倍，是 Fluo-3 的 4 倍。除了亮度优势外，Fluo-8® 比其他探针的温度依赖性更低，无论在室温还是 37°C 下都能获得更一致和可重复的结果。在这些条件下，Fluo-8® 可在 30 分钟或更短时间内轻松负载到细胞中。Fluo-8® 及其类似物有四种不同形式，各自具有不同的钙结合亲和力。Fluo-8® 的 Kd 约为 389 nM，Fluo-8® H 的 Kd 约为 232 nM，Fluo-8®L 的 Kd 约为 1.86 µM，Fluo-8®FF 的 Kd 约为 10 µM（均在规定的体外条件下测定）。Fluo-8® L 和 Fluo-8® FF 具有显著较低的 Ca²⁺ 结合亲和力，因此更适合检测微摩尔范围内的细胞内 Ca²⁺ 水平。
| Fig. 1 | ||
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| 在HEK-293细胞中测量的卡巴胆碱剂量响应。HEK-293细胞以40,000个细胞/100 µL/孔过夜接种于Costar黑壁透明底96孔板。使用Fluo-8® AM（货号21083）或Fluo-4 AM（货号20550）的染料负载液（100 µL）在室温下与细胞孵育1小时。通过NOVOstar（BMG Labtech）加入卡巴胆碱（50 µL/孔）以达到所示的终浓度 |
AM酯和盐衍生物
AM Ester and Salt Derivatives
Fluo-8® 可作为膜通透性乙酰氧基甲酯（AM酯）或膜不通透性盐使用。作为 AM 酯，Fluo-8® AM 增加的疏水性使其能够轻易穿透活细胞的完整膜，并通过非特异性胞内酯酶的水解激活Fluo-8® 的钙敏感荧光。细胞也可以通过物理方式负载膜不通透性钙指示剂，如盐衍生物和葡聚糖偶联物。常见的细胞负载技术包括膜片钳、显微注射或胞饮加载。Fluo-8® 应在 ≤ -20°C下干燥避光保存。收到时，AM酯通常可在至少六个月内保持稳定，但需注意它们易受水解影响，特别是在溶液中储存时。
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筛选 GPCR 和钙通道靶点
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Screen Quest™ 钙流检测试剂盒是基于细胞的高通量筛选（HTS）中，确定通过G蛋白偶联受体（GPCR）的激动剂刺激和拮抗剂抑制信号传导的优先选择方法。迄今为止，市场上约三分之一的药物是针对GPCR设计的。Screen Quest™ Fluo-8® 免洗钙检测试剂盒提供了一种便捷的免洗、均相荧光检测方法，用于检测广泛生物靶标中的细胞内钙动员。Screen Quest™ Fluo-8® 免洗钙检测试剂盒包含优化的检测方法，用于监测GPCR和钙通道。与Fluo-3 AM和Fluo-4 AM均需 37°C 以实现最佳细胞负载不同，Screen Quest™ Fluo-8® 免洗钙检测试剂盒对温度依赖性较低的细胞负载方案，在室温或 37°C 下均可获得相似结果。这一特性使 Screen Quest™ Fluo-8® 免洗钙检测试剂盒在 HTS 应用中更加稳健。此外，它能够从弱信号和强信号检测体系中产生非常大的信号，使研究人员能够针对不同受体和钙通道靶点使用多种检测化学方法。该检测可在便捷的96孔或384孔微孔板格式中进行，并可轻松适应自动化。Screen Quest™ 钙流检测试剂盒已针对以下仪器进行了优化和验证：FDSS®、FLIPR®、ViewLux™、NOVOStar、ArrayScan™、FlexStation® 和 IN Cell Analyzer。
Screen Quest™ Fluo-8® 关键特点
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经广泛微孔板读数仪验证的优化方案
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卓越的信号强度（高 S/B 比）和孔间均一性
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用于检测挑战性细胞系和受体的大检测窗口
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适用于1536孔板的高性能钙流检测
| Fig. 2 | ||
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| 卡巴胆碱剂量响应。HEK-293细胞以40,000个细胞/100 µL/孔过夜接种于Costar黑壁透明底96孔板。使用Screen Quest™ Fluo-8免洗钙检测试剂盒或Fluo-4 NW试剂盒（按制造商说明）的染料负载液（100 µL）在室温下与细胞孵育1小时。通过NOVOstar（BMG Labtech）加入卡巴胆碱（50 µL/孔）以达到所示的终浓度 |
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改善结果的技巧
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负载Fluo-8® 的细胞显示出较大的动态范围，对检测基本和全局 Ca²⁺ 通量非常敏感。然而，Fluo-8®易受对37°C敏感的有机阴离子转运蛋白的染料外排影响。为改善细胞留滞性，可在染料工作液中加入丙磺舒等试剂。丙磺舒通过抑制质膜上的有机阴离子转运蛋白发挥作用，从而减少细胞内的染料外排。丙磺舒在某些细胞类型和实验条件下可能表现出细胞毒性效应，且虽然它抑制特定的有机阴离子转运蛋白，但可能改变其他转运通路，需要谨慎优化。为改善 M酯的水溶性，也可向Fluo-8® 工作液中加入Pluronic® F-127。Pluronic® F-127是一种非离子表面活性剂，具有活性且对细胞相对无毒。在低温下它是可溶的，但在室温下Pluronic® F-127会凝胶化。
如需了解无需丙磺舒即可良好留滞的钙指示剂，请参见Cal-520® 与 Cal™ 指示剂目录。
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→ 钙离子指示剂Fluo-8®、Cal-520® 全系列 | 活细胞钙流检测
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